rokazyme生產(chǎn)和銷售用于研究，診斷和工業(yè)測試目的的新型酶。該公司成立于2006年，是冰島生物技術(shù)公司Prokaria的副產(chǎn)品，該公司后來合并為非營利性國有企業(yè)Matis。Prokazyme基于二十年的地?zé)嵘锟碧剑⑸锘蚪M學(xué)和酶發(fā)現(xiàn)。Prokazyme（作為中小企業(yè)）與馬蒂斯組成了一個研究聯(lián)盟，并共同參與了由歐盟資助的一些研究項目。持續(xù)的研發(fā)和與Matis的戰(zhàn)略聯(lián)盟使Prokazyme有機會開發(fā)大量不斷增長的嗜熱細菌和病毒基因數(shù)據(jù)庫，并繼續(xù)開發(fā)新的*酶產(chǎn)品。

Ice and Fire Phosporylation Kit / PNK and Alkaline phosphatase

冰和火磷酸化試劑盒/ PNK和堿性磷酸酶

Ice and Fire™磷酸化試劑盒包括用于核酸5'末端標(biāo)記的優(yōu)化試劑。

Ice and Fire™磷酸化試劑盒包括用于核酸5'末端標(biāo)記的優(yōu)化試劑。該新方案通過結(jié)合不耐熱蝦堿性磷酸酶（SAP）的低溫活性和熱穩(wěn)定的ThermoPhage™多核苷酸激酶（PNK）的高溫活性，提供簡單的“一步”處理。蝦堿性磷酸酶從核酸的5'末端消化單磷酸，二磷酸和三磷酸，留下5'羥基。PNK催化γ磷酸從ATP轉(zhuǎn)移到核酸分子的5'-OH。在簡化的溫度控制程序中兩種酶的組合允許磷酸化核酸的快速和有效的5'末端標(biāo)記。

可作為50個反應(yīng)的套件提供。

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產(chǎn)品  ：  IaF170S  | Ice and Fire kit 50反應(yīng)  | 價格：220.00 EUR

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有關(guān)詳細信息，請參閱下文或下載說明書

背景：
Ice and Fire Phosphorylation試劑盒為核酸的5'末端標(biāo)記提供了優(yōu)化的試劑。簡單的方案利用低溫和高溫來控制不耐熱的蝦堿性磷酸酶（SAP）和熱穩(wěn)定的ThermoPhage™多核苷酸激酶（PNK）在一種溶液和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液（專項技術(shù)申請中）中的活性。該試劑盒旨在用末端單磷酸，二磷酸或三磷酸標(biāo)記DNA或RNA分子的5'末端。其他核酸如PCR產(chǎn)物，寡核苷酸，限制性消化的質(zhì)粒DNA或復(fù)合物樣品RNA或DNA也可用該試劑盒標(biāo)記?；膶嶋H上可以是任何長度。具有5'-磷酸的核酸需要在激酶反應(yīng)之前去磷酸化。該試劑盒包括蝦堿性磷酸酶和熱穩(wěn)定多核苷酸激酶酶混合物。這允許在較低溫度下核酸的去磷酸化，然后在加入放射性標(biāo)記的[γ-32 P] ATP之前加熱滅活磷酸酶并通過新型熱穩(wěn)定多核苷酸激酶（1）進行標(biāo)記。SAP變性和PNK反應(yīng)在70℃下進行。加熱步驟后無法檢測到SAP活性，然后進行PNK反應(yīng)。具有5'-羥基（-OH）基團的核酸也可以使用該試劑盒標(biāo)記。在這種情況下，磷酸酶通過加熱直接滅活，然后加入γ放射性標(biāo)記的ATP并在70℃溫育。SAP變性和PNK反應(yīng)在70℃下進行。加熱步驟后無法檢測到SAP活性，然后進行PNK反應(yīng)。具有5'-羥基（-OH）基團的核酸也可以使用該試劑盒標(biāo)記。在這種情況下，磷酸酶通過加熱直接滅活，然后加入γ放射性標(biāo)記的ATP并在70℃溫育。SAP變性和PNK反應(yīng)在70℃下進行。加熱步驟后無法檢測到SAP活性，然后進行PNK反應(yīng)。具有5'-羥基（-OH）基團的核酸也可以使用該試劑盒標(biāo)記。在這種情況下，磷酸酶通過加熱直接滅活，然后加入γ放射性標(biāo)記的ATP并在70℃溫育。

優(yōu)點：

磷酸化核酸的有效5'末端標(biāo)記，單鏈或雙鏈

酶活性的簡單溫度控制

在反應(yīng)之間不需要額外的清除步驟如苯酚/chloroform或旋轉(zhuǎn)柱，僅SAP的熱變性

單管格式，簡化程序

應(yīng)用：5' - 磷酸化DNA和RNA的終標(biāo)記：

核酸酶保護測定

雜交印跡

定量PCR

產(chǎn)品組件：

10X反應(yīng)緩沖液

SAP / PNK酶混合物

磷酸化的ssDNA寡聚體（10pmol /μL）用作陽性對照

套件未隨附的組件：

放射性標(biāo)記的γ-ATP [32P]

ATP

無核酸酶水

議定書：

核酸5'放射性標(biāo)記方案：冰與火磷酸化試劑盒提供對照和優(yōu)化試劑，可快速方便地標(biāo)記DNA或RNA

1）靶核酸的去磷酸化（SAP反應(yīng)）：
10x SAP / PNK緩沖液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶DNA / RNA 
10-100pmol無核酸酶水至
24μL在37°C孵育60分鐘

2）靶核酸的磷酸化（PNK反應(yīng)）：
在37℃溫育后，將樣品加熱至70℃。在70℃下15分鐘后，向反應(yīng)中加入XμL放射性標(biāo)記的[γ-32 P] ATP，相當(dāng)于待標(biāo)記末端的2-5摩爾過量ATP（例如使用7,000 Ci / mmol，150 mCi / ml [γ] -32 P] ATP，1μL約為25 pmol）。在70°C孵育另外30-60分鐘。冷卻至+ 4°C或置于冰上以阻止反應(yīng)。

任選：加入1mM EDTA和/或在95℃加熱反應(yīng)5分鐘以終止反應(yīng)。

任選：通過旋轉(zhuǎn)柱（例如Qiagen核苷酸去除試劑盒，目錄號28304或等效的旋轉(zhuǎn)柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝膠純化來清潔探針。（2）。

放射性標(biāo)記的核酸現(xiàn)在可以使用了

第二議定書：

用于5'標(biāo)記5'羥基化核酸的方案：Prokazyme Ltd也提供ThermoPhage TM PNK用于標(biāo)記5'羥基化核酸，但Ice and Fire磷酸化試劑盒也可用于此類應(yīng)用。

1）反應(yīng)混合物
10x SAP / PNK緩沖液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶DNA / RNA 
10-100pmol無核酸酶水至
24μL在70℃孵育15分鐘以滅活SAP酶。

2）靶核酸的多核苷酸激酶5'標(biāo)記：
將XμL放射性標(biāo)記的[γ-32 P] ATP加入到相當(dāng)于2-5摩爾過量ATP的反應(yīng)中，待標(biāo)記的末端（例如使用7,000 Ci / mmol，150 mCi） / ml [γ-32 P] ATP，1μL約為25pmol）。
在70°C孵育60分鐘。冷卻至+ 4°C或置于冰上以阻止反應(yīng)。

任選：加入1mM EDTA和/或在95℃加熱反應(yīng)5分鐘以終止反應(yīng)。

任選：通過旋轉(zhuǎn)柱（例如Qiagen核苷酸去除試劑盒，目錄號28304或等效的旋轉(zhuǎn)柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝膠純化來清潔探針。（2）。

放射性標(biāo)記的核酸現(xiàn)在可以使用了

方案III：

沒有放射性ATP的磷酸化：該試劑盒也可用于在克隆程序等之前磷酸化5'羥基化核酸。

1）反應(yīng)混合物
10x SAP / PNK緩沖液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶DNA / RNA 1-500pmol無
核酸酶水至
24μL在70℃孵育15分鐘以滅活SAP酶。

2）靶核酸的多核苷酸激酶5'磷酸化：
將ATP加入到反應(yīng)中至終濃度為10-100μM（至少兩倍于核酸末端的磷酸化濃度）。
在70°C孵育60分鐘。冷卻至+ 4°C或置于冰上以阻止反應(yīng)。

任選：通過旋轉(zhuǎn)柱（例如Qiagen核苷酸去除試劑盒，目錄號28304或等效的旋轉(zhuǎn)柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝膠純化來清潔探針。（2）。

現(xiàn)在核酸已準(zhǔn)備好用于克隆程序

評估協(xié)議：

如果需要確定特定放射性或如果研究人員想要評估反應(yīng)效率，則可以使用以下評估方案。請注意，此評估需要閃爍計數(shù)器，閃爍液和DE81過濾器或等效儀器和組件。將1μL反應(yīng)物稀釋至1/10并將1μL點稀釋至Whatman Inc.DE81過濾器（目錄號3658023）或其等同物。作為陽性對照，將相同的量放在一個不經(jīng)過洗滌步驟的過濾器上。沒有酶混合物的反應(yīng)溶液可用作陰性對照并用樣品洗滌。將樣品和陰性對照濾膜在400ml磷酸鈉緩沖液pH7中洗滌兩次30分鐘，干燥并放入閃爍計數(shù)瓶中，加入閃爍液并在液體閃爍計數(shù)器中計數(shù)放射性。為了確定標(biāo)記的核酸的比活性，計算摻入反應(yīng)中的總cpm并將其除以pmol中標(biāo)記的核酸的量。

（#total cpm合并*稀釋因子*體積）/（#total pmol核酸）

預(yù)期的比活性：
當(dāng)具有7000 Ci / mmol的比活性的[γ-32P] ATP用于激酶反應(yīng)時，核酸應(yīng)在參考日期標(biāo)記至至少1×10 6 cpm / pmol。在放射性標(biāo)記的ATP小瓶上標(biāo)明的參考日32P的衰變可以計算為:(原始cpm /μl）/（2（天/ 14.3））

參考文獻：

Blondal，T.，Hjorleifsdottir，S.，Aevarsson，A.，F(xiàn)ridjonsson，OH，Skirnisdottir，S.，Wheat，JO，Hermannsdottir，AG，Hreggvidsson，GO，Smith，AV and Kristjansson，JK（2005）J Biol Chem， 280,5188-5194。

Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，EF和T.，M。（1989）Molecular cloning，a laboratory manual。冷泉港實驗室，紐約冷泉港。

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